使用前仔細閱讀本說明書。本酶聯免疫試劑盒是基於生物素雙抗體夾心技術原理，來檢測小鼠Toll樣受體4(TLR4))，只能用于研究用途，不得用於醫學診斷。
用 途： 用於小鼠血清、血漿及相關液體樣本中Toll樣受體4(TLR4)的測定。
工作原理
本試劑盒採用的是生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定樣品中小鼠Toll樣受體4(TLR4)的水平。向預先包被了小鼠Toll樣受體4(TLR4)單克隆抗體的酶標孔中加入Toll樣受體4(TLR4)，溫育；溫育后，加入生物素標記的抗TLR4抗體，再與鏈霉親和素-HRP結合，形成免疫復合物，再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然後加入底物A、B，產生藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中小鼠Toll樣受體4(TLR4)的濃度呈正相關。
試劑盒組成
1 | 標準品（16ng/ml） | 0.5ml | 7 | 顯色劑A液 | 6ml |
2 | 標準品稀釋液 | 3ml | 8 | 顯色劑B液 | 6ml |
3 | 酶標包被板 | 12孔×8條 | 9 | 終止液 | 6ml |
4 | 鏈霉親和素-HRP | 6ml | 10 | 說明書 | 1份 |
5 | 30倍濃縮洗滌液 | 20ml | 11 | 封板膜 | 2張 |
6 | 生物素標記的抗- TLR4抗體 | 1ml | 12 | 密封袋 | 1個 |
需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恆溫箱。
2． 標準規格酶標儀。
3． 精密移液器及一次性吸頭
4． 蒸餾水，
5． 一次性試管
6． 吸水紙
注意事項
1． 從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2． 各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其準確性，以避免試驗誤差。
3． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。
4． 為避免交叉污染，要避免重複使用手中的吸頭和封板膜。
5． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
6． 底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊几層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重複此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
標本要求
1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
2．標本採集后儘早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應儘快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融
操作程序
1． 標準品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋）：
8ng/ml | （5號標準品） | 120μl的原倍標準品加入120μl的標準品稀釋液 |
4ng/ml | （4號標準品） | 120μl的5號標準品加入120μl的標準品稀釋液 |
2ng/ml | （3號標準品） | 120μl的4號標準品加入120μl的標準品稀釋液 |
1ng/ml | （2號標準品） | 120μl的3號標準品加入120μl的標準品稀釋液 |
0.5ng/ml | （1號標準品） | 120μl的2號標準品加入120μl的標準品稀釋液 |
2． 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的儘量做復孔。
3． 加樣：1）空白孔：空白對照孔不加樣品，生物素標記的抗TLR4抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其餘各步操作相同；2）標準品孔：加入標準品50μl，鏈黴素-HRP50μl（標準品中已事先整合好生物素抗體，故不加）；3)待測樣品孔:加入樣本40μl，然後各加入抗- TLR4抗體10μl、鏈酶親和素-HRP50μl，蓋上封板膜，輕輕振盪混勻，37℃溫育60分鐘。
4． 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋後備用。
5． 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重複5次，拍干。
6． 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震盪混勻，37℃避光顯色10分鐘。
7． 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
8． 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后10分鐘以內進行。
9.根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。
